Геном денисовского человека, прочтённый вчерне в 2010 году, удалось отсеквенировать "набело" (с 30‑кратным покрытием) благодаря новым методам работы с древней ДНК. Анализ денисовского генома подтвердил, что сапиенсы после своего выхода из Африки скрещивались с архаичным евразийским населением - неандертальцами и денисовцами. Исследование также показало, что денисовцы были малочисленной популяцией с крайне низким уровнем генетического разнообразия. Важнейшим результатом является составление подробного каталога генетических изменений, закрепившихся у сапиенсов после их отделения от общих с денисовцами предков. Некоторые из этих изменений затронули гены, влияющие на работу нейронов и развитие мозга. Это значит, что между психикой сапиенсов и денисовцев могли быть генетически обусловленные различия.
1. От "черновика" к "чистовику"
В 2010 году были отсеквенированы ядерные геномы представителей двух вымерших человеческих популяций - неандертальцев и денисовцев. Оба прочтённых генома, неандертальский и денисовский, были "черновыми". Это значит, что для большинства участков генома нуклеотидную последовательность удалось восстановить на основании лишь очень небольшого количества отсеквенированных фрагментов древней ДНК. Для денисовского генома, основанного на ДНК из найденной в Денисовой пещере фаланги мизинца девочки, удалось получить "покрытие" (coverage), равное 1,9, то есть каждый участок генома был прочтён в среднем 1,9 раз. Опубликованный неандертальский геном имеет среднее покрытие около 1,3 и составлен из фрагментов ДНК трёх индивидуумов. Этого достаточно, чтобы охарактеризовать геном в самых общих чертах, но слишком мало для решения многих интересных задач. В частности, по такому "черновому" геному невозможно понять, насколько отличались друг от друга гены, полученные денисовской девочкой от отца и матери, а без этих данных ничего нельзя сказать о генетическом разнообразии денисовцев и их популяционной истории.
30 августа на сайте журнала "Science" появилась долгожданная статья, в которой коллектив палеогенетиков, возглавляемый Сванте Пеэбо из института Эволюционной антропологии им. Макса Планка в Лейпциге, сообщил, что им удалось радикально повысить качество прочтения денисовского генома. Теперь он отсеквенирован со средним покрытием 31 (99,4% нуклеотидов прочтено не менее 10 раз, 92,9% - не менее 20) и не уступает по качеству отсеквенированным геномам ныне живущих людей. Правда, это относится лишь к наиболее "осмысленной" части генома (размером в 1,86 миллиардов пар нуклеотидов из примерно трёх миллиардов), в которой преобладают уникальные последовательности (а не повторы). Дело в том, что ДНК сохраняется в ископаемых костях в основном в виде коротеньких обрывков длиной в несколько десятков нуклеотидов. Если последовательность нуклеотидов в таком обрывке не уникальна, то её нельзя "картировать", то есть привязать к какому-то конкретному месту в геноме.
Тем не менее, содержательная часть денисовского генома, к которой принадлежат практически все белок-кодирующие гены и важнейшие регуляторные участки, теперь реконструирована с поразительной точностью. Этого удалось добиться благодаря новой методике работы с древней ДНК, которую изобрёл первый автор статьи Маттиас Майер (Matthias Meyer). По его словам, "никто не ожидал, что удастся получить такой высококачественный геном древнего человека. Все были шокированы результатом, включая меня".
2. Новый способ секвенирования древней ДНК
Ископаемые кости обычно сильно загрязнены современной ДНК, в основном бактериальной, так что доля подлинной древней ДНК составляет всего несколько процентов. В фаланге из Денисовой пещеры содержание древней ДНК исключительно высокое (70%), однако в распоряжении исследователей был лишь крошечный фрагмент этой косточки, поэтому было очень важно ничего не потерять.
До сих пор палеогенетики пользовались технологиями секвенирования, разработанными для современных организмов. Эти методы ориентированы на работу с молекулами ДНК в их "стандартной" конфигурации, то есть в форме двойной спирали. Однако многие фрагменты древней ДНК, выделенные из ископаемых костей, частично или полностью распадаются на одиночные нити, или одна из нитей двойной спирали оказывается повреждена. До сих пор в ходе палеогенетических исследований такие фрагменты терялись. Разработанная Мейером методика позволяет их поймать и отсеквенировать наряду с обычными, двухнитевыми фрагментами. Для этого к 3’‑концам одноцепочечных фрагментов древней ДНК присоединяют биотинилированные (то есть связанные с биотином) олигонуклеотиды - "адаптеры". Адаптер затем используется в качестве праймера (затравки) для синтеза недостающей комплементарной цепи ДНК на матрице исходного одноцепочечного фрагмента, который в итоге становится двухцепочечным, после чего его можно секвенировать стандартными методами (подробное описание методики приведено в дополнительных материалах к обсуждаемой статье). Новая методика позволила на порядок увеличить количество древней ДНК, доступной для секвенирования, что и обеспечило успех предприятия.
3. Новые датировки
Для сравнения авторы отсеквенировали (с покрытием от 24 до 33) геномы 11 современных людей: пятерых африканцев, двух европейцев, трёх азиатов и южноамериканского индейца. Сравнение всех этих геномов между собой и с геномом денисовской девочки показало, что предки сапиенсов и денисовцев отделились друг от друга в промежутке от 170 до 700 тысяч лет назад. Столь низкая точность связана с тем, что недавние исследования заставили усомниться в имеющихся оценках скорости мутирования у людей, а не зная скорость мутирования, нельзя откалибровать "молекулярные часы", используемые для вычисления времени расхождения популяций.
Авторы обнаружили, что денисовский геном чуть больше похож на геном шимпанзе, чем геномы современных людей (между геномами денисовца и шимпанзе на 1,16% меньше различий). Скорее всего, это объясняется тем, что у современных людей было больше времени на накопление отличий от шимпанзе, чем у денисовской девочки, жившей несколько десятков тысячелетий назад. Если это так и если скорость накопления изменений в ДНК была примерно постоянной (допущение, лежащее в основе принципа "молекулярных часов"), то данную величину (1,16%) можно использовать для датирования денисовской фаланги. Если предки людей и шимпанзе разделились 6,5 млн лет назад и от этого момента до смерти денисовской девочки прошло на 1,16% меньше времени, чем до современности, то получается, что возраст находки - примерно 75 тысяч лет. Это, пожалуй, первая серьёзная попытка использовать палеогенетические данные для датировки ископаемых остатков, и мы пока ничего не можем сказать о надёжности такого метода. Материалы из Денисовой пещеры пока не удается датировать с достаточной точностью стандартными способами. До сих пор возраст слоя, в котором была найдена фаланга, приблизительно оценивался в 30–50 тысяч лет. Если дальнейшие исследования подтвердят, что возраст косточки ближе к 75 000 лет, чем к 50 000, это станет серьёзным аргументом в пользу правомочности нового "палеогенетического" метода датирования.
4. Новые данные о гибридизации сапиенсов с архаичными евразийскими популяциями
Анализ подтвердил, что некоторые популяции древних сапиенсов, а именно предки современных папуасов и австралийцев, скрещивались с денисовцами и унаследовали от них до 6% своей ДНК. В геномах других азиатских народов заметных денисовских примесей не обнаружено.
Некоторые результаты оказались неожиданными. Так, авторы обнаружили, что у жителей Северного и Южного Китая, а также у южноамериканского индейца больше общих аллелей с денисовцами, чем у европейцев. При этом большая часть "избыточных" архаичных аллелей в геномах жителей Восточной Азии роднит их не только с денисовцами, но и с неандертальцами, поскольку эти аллели одинаковы у неандертальцев и денисовцев. Таким образом, они указывают скорее на неандертальскую, чем на денисовскую примесь. Ранее было установлено, что внеафриканские сапиенсы скрещивались с неандертальцами вскоре после своего выхода из Африки. Было это, скорее всего, на Ближнем Востоке. Новые данные позволяют предположить дополнительный (второй) эпизод гибридизации сапиенсов с неандертальцами в Восточной Азии, в котором участвовали предки современных китайцев и индейцев. Для окончательного прояснения этого вопроса, по-видимому, придётся подождать, пока Пеэбо и его коллеги отсеквенируют неандертальский геном так же качественно, как денисовский.
Ещё один неожиданный результат состоит в том, что в геноме папуаса участки денисовского происхождения на Х‑хромосоме встречаются реже, чем на остальных хромосомах (аутосомах). Этот факт можно объяснить по-разному. Он может означать, что в гибридизации принимали участие со стороны сапиенсов в основном женщины, а со стороны денисовцев - мужчины, или что между двумя популяциями в то время уже существовала частичная генетическая несовместимость, и поэтому естественный отбор впоследствии удалил из папуасского генофонда значительную часть денисовских фрагментов Х‑хромосомы (внутригеномные конфликты сильнее проявляются и потому "заметнее" для отбора, если конфликтующие гены сидят на Х‑хромосоме).
5. Денисовцы были малочисленны и генетически однообразны
Высокий уровень "покрытия" при секвенировании денисовского генома позволил авторам с большой точностью оценить степень гетерозиготности денисовской девочки, то есть уровень различий между генами, полученными ею от отца и матери. Этот уровень оказался впятеро ниже, чем у современных африканцев, вчетверо ниже, чем у современных европейцев и азиатов, и почти втрое ниже, чем у южноамериканского индейца (народность каритиана, к которой принадлежит этот индеец, отличается крайне низким уровнем гетерозиготности). Короче говоря, родители денисовской девочки генетически очень мало отличались друг от друга.
Теоретически, этот результат можно было бы объяснить тем, что девочка родилась от близкородственного брака. Но тогда в её геноме присутствовали бы многочисленные длинные участки, полностью лишенные гетерозиготных локусов, чего не наблюдается. Следовательно, дело тут не в близком родстве родителей девочки, а в крайне низком уровне генетического разнообразия популяции денисовцев.
Недавно были разработаны статистические методы, позволяющие на основе анализа одного-единственного генома оценить изменения численности популяции в прошлом (Li, Durbin, 2011. "Inference of human population history from individual whole-genome sequences" // Nature. V. 475. Pp. 493–496). Применив эти методы к анализируемым геномам, авторы пришли к выводу, что численность предков современных людей и денисовцев в глубокой древности (500 тысяч и более лет назад) менялась синхронно. Очевидно, это была одна и та же, ещё не разделившаяся популяция. Позже, примерно 250–125 тысяч лет назад, численность предков современных народов стала быстро расти, а предки денисовцев, напротив, сократились в числе и оставались малочисленными вплоть до эпохи, когда жила денисовская девочка. Примерно 100–50 тысяч лет назад предки нынешних европейцев и азиатов прошли через "бутылочное горлышко", то есть испытали резкое снижение численности, соответствующее выходу из Африки небольшой группы мигрантов - предков современного внеафриканского человечества. Предки современных африканских народов, оставшиеся на родине, в это время испытали менее выраженное снижение численности.
Если денисовцы действительно были малочисленнее древних сапиенсов, это должно было отразиться на эффективности действовавшего на них отбора. Известно, что в маленьких популяциях естественный отбор хуже справляется с отбраковкой слабовредных мутаций. Эффективность этой отбраковки можно оценить по соотношению значимых и незначимых (синонимичных) нуклеотидных замен в белок-кодирующих генах. Слабый очищающий отбор должен приводить к ускоренному накоплению значимых замен (потому что большинство значимых мутаций, как известно, вредны). Следовательно, если денисовцы были малочисленнее сапиенсов, то у первых доля значимых замен должна быть выше, чем у вторых. Так и оказалось: у денисовцев отношение значимых замен к незначимым в белок-кодирующих последовательностях в 1,5–2,5 раза выше, чем у сапиенсов. Этот результат - дополнительное свидетельство в пользу низкой численности популяции денисовцев.
6. Каталог различий
В геноме человека известны полиморфные нуклеотидные позиции (нуклеотиды, которые могут быть разными у разных индивидов), по которым можно судить о таких фенотипических признаках, как цвет кожи, волос и глаз. Если соотношение между этими генетическими вариантами и внешними признаками у денисовцев было таким же, как у сапиенсов (что весьма вероятно, хотя и не известно наверняка), то девочка из Денисовой пещеры была брюнеткой с карими глазами и смуглой кожей без веснушек.
Авторам удалось показать, что у денисовцев, как и у сапиенсов, было 23 пары хромосом, а не 24, как у шимпанзе и других человекообразных обезьян. Известно, что вторая хромосома человека возникла путём слияния двух предковых хромосом. Следы этого события сохранились в структуре второй хромосомы: в её средней части имеются две сомкнутые повторяющиеся последовательности, характерные для теломер - концевых участков хромосом. Этот уникальный стык двух теломерных последовательностей обнаружен и в денисовском геноме. Следовательно, две предковые хромосомы слились ещё до разделения линий сапиенсов и денисовцев.
Пожалуй, самым важным результатом исследования является составление полного каталога генетических изменений, которые произошли у наших предков-сапиенсов после их отделения от предков денисовцев. В каталог попали те нуклеотидные позиции, которые у денисовцев остались в "предковом" состоянии (как у шимпанзе), а у современных сапиенсов изменились, причём эти изменения либо зафиксировались в человеческой популяции, либо почти зафиксировались, то есть достигли высокой частоты (имеются у большинства современных людей). Аналогичный список уникальных "продвинутых" аллелей был составлен и для денисовского генома, но он не так ценен, потому что нам пока известен геном только одного денисовца и мы не можем отличить аллели, характерные для всех денисовцев, от индивидуальных генетических особенностей одной конкретной девочки.
Каталог наших недавних генетических "приобретений", составленный авторами, включает 111 812 однонуклеотидных замен и 9 499 вставок (инсерций) или выпадений (делеций). Это то, что отличает современных людей от общих с денисовцами предков, живших несколько сотен тысячелетий назад. Подавляющее большинство этих мутаций затронули участки генома, не имеющие существенного функционального значения. Лишь 260 из них привели к замене аминокислоты в белке, ещё 72 могли повлиять на сплайсинг; наконец, 35 мутаций находятся в известных регуляторных участках и могли повлиять на регуляцию работы генов.
Но даже и из этого весьма небольшого числа потенциально важных мутаций большая часть, скорее всего, не оказала заметного влияния на фенотип. По-настоящему важными могут оказаться 23 мутации, затронувшие наиболее консервативные участки белок-кодирующих последовательностей (то есть такие участки, которые в ходе эволюции приматов менялись очень редко или не менялись вовсе). Интересно, что 8 из этих 23 специфичных для нашего вида мутаций закрепились в генах, связанных с развитием нервной системы, передачей нервных импульсов и работой мозга. В частности, у наших предков после их отделения от предков денисовцев изменились гены ADSL и CNTNAP2, для которых показана связь с аутизмом. Ген CNTNAP2 также связан с нарушениями речи и находится под контролем знаменитого гена-регулятора FOXP2. Это позволяет предположить, что какие-то наши умственные и психические особенности ещё продолжали эволюционировать после разделения предков сапиенсов и денисовцев и что мы, следовательно, чем-то отличаемся от денисовцев в этом плане.
Изменения также произошли в нескольких генах, связанных со зрением, кожей и зубами. Детальный анализ и выявление функциональной роли выявленных генетических изменений - дело будущего. Это поможет понять, почему сапиенсы в итоге заселили весь мир, а денисовцы и неандертальцы вымерли, оставив лишь маленький след в генофонде современного человечества.
Источники:
Автор: Александр Марков
Источник: Элементы